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am leichtesten zerschütteln lassen und weil ihre feinkörnige Zellsubstanz die Anwesenheit oder das Fehlen des Kernes am klarsten feststellen läßt. Ich habe die Versuche in der nämlichen Weise ausgeführt, wie im Jahr 1889 (7). Die unbefruchteten Eier wurden durch kräftiges Schütteln in einem Reagenzröhrchen fragmentiert, das ganze Material dann durch mehrmaliges Absetzenlassen und Erneuern des Wassers gereinigt, worauf unter dem Mikroskop möglichst große kernlose und entsprechende kernhaltige Fragmente ausgewählt und isoliert wurden. Nachdem sich seither H. WINKLER (53), E. B. WILSON (51) und PETRUNKEWITSCH (39) des gleichen Verfahrens zur Gewinnung kernloser Eifragmente bedient haben, wird dessen Zuverlässigkeit keinem Einwand mehr begegnen.

Die von einem und demselben Weibchen isolierten kernlosen und kernhaltigen Bruchstücke wurden sodann mit Sperma des gleichen Männchens befruchtet und nach Eintreten der ersten Zellteilung kontrolliert. Nur die zur richtigen Zeit in zwei Zellen geteilten Eier wurden weiter gezüchtet, ungeteilte oder mehrteilige beseitigt.

Versuche dieser Art, so einfach sie an sich sind, hängen von einer Reihe von Umständen ab, und man darf nicht auf unfehlbares Gelingen rechnen. Aus zahlreichen Erfahrungen glaube ich schließen zu dürfen, daß, je leichter sich Eier zerschütteln lassen, um so leichter auch die sich entwickelnden Fragmente schädigenden Einflüssen erliegen. Auch individuell sind in dieser Beziehung die einzelnen Eier offenbar verschieden. Daß die Prozeduren des Isolierens sehr häufig schädigend wirken, davon kann man sich durch Vergleichung mit Massenkulturen leicht überzeugen. Auch ist, wie schon früher angedeutet, nicht zu bezweifeln, daß kernlose Fragmente im allgemeinen weniger widerstandsfähig sind als kernhaltige. Des weiteren ist zu beachten, daß nach meinen Versuchen an Strongylocentrotuseiern (14, 15) rein animale Fragmente sich nicht über das Blastulastadium hinaus entwickeln, was vermutlich für Echinus gleichfalls gilt. Auch dieses Moment kann unter Umständen zu Mißerfolgen führen.

So ist es erklärlich, daß auch unter meinen Versuchen im Winter 1901/1902 zuerst mehrere waren, die aus dem einen oder anderen Grund ungenügend oder wenigstens nicht ganz befriedigend ausfielen, bis endlich einer in jeder Hinsicht so tadellos gelang, daß damit dieser Teil der gestellten Aufgabe als erledigt betrachtet werden durfte. Ich setze die Ergebnisse dieses letzten Versuches

an den Anfang, um dann noch auf einige der vorausgehenden zurückzukommen.

Versuch vom 31. März 1902.

Es wurden aus zerschüttelten Eiern von Echinus microtuberculatus einerseits 21 kernhaltige, andererseits 36 kernlose Stücke isoliert und dann befruchtet. Die kernhaltigen lieferten 13, die kernlosen 7 wohlgebildete Plutei, welche jedoch sämtlich in ihrer Entwickelung so träg waren, daß erst am 3. April das Stadium des jungen Pluteus erreicht war, in welchem sie durch Formolzusatz getötet wurden.

Zwei in Größe und Form nahezu übereinstimmende Objekte sind in Figg. 1a und 2a (Taf. I) abgebildet, das erstere aus einem der isolierten kernhaltigen, das letztere aus einem der kernlosen Fragmente stammend. Ein auffallender Unterschied liegt in der völligen Pigmentlosigkeit der hemikaryotischen Larve. Auch 4 andere der 7 hemikaryotischen Plutei zeigten diese Eigentümlichkeit. In der Nachbarschaft des Skelettes waren, wie die Figuren zeigen, einzelne der primären Mesenchymzellen (Kalkbildner) mit Sicherheit an ihrer glatten kugeligen Oberfläche zu erkennen. Man bemerkt, daß die der hemikaryotischen Larve erheblich kleiner sind; die Durchmesser verhalten sich ungefähr wie 3: 4.

Die Analwand dieser beiden Plutei nach den gefärbten Präparaten ist in Figg. 1b und 2b gezeichnet. Die Kerne sind so genau wie möglich mit dem Zeichenapparat eingetragen; außerdem wurden bei Anfertigung der Zeichnungen noch Photogramme zu Hilfe genommen, welche ich der Freundlichkeit des Herrn Kollegen SOBOTTA verdanke. Ich hatte ursprünglich die Absicht gehabt, die festgestellten Kernverhältnisse durch Reproduktionen solcher Photographien zu illustrieren, mußte mich aber alsbald überzeugen, daß damit sehr wenig genützt wäre. Bei der starken Krümmung der Larvenflächen, welche bei stärkerer Vergrößerung immer nur ganz wenige Kerne scharf einzustellen erlaubt, sind die Photographien so unvollkommen und geben besonders von den nicht scharf abgebildeten Kernen so ungenaue Bilder, daß eine sorgfältig ausgeführte Zeichnung bei weitem vorzuziehen ist. Ich glaube dafür einstehen zu können, daß der Größenunterschied der Kerne, wie ihn die Figuren zeigen, jedenfalls nicht übertrieben ist.

Figg. 1c und 2c zeigen bei stärkerer Vergrößerung kleine Stücke optischer Durchschnitte von entsprechenden Stellen der

Scheitelwand der beiden Plutei; ich komme auf diese Bilder unten zurück.

Wie ich schon bei anderer Gelegenheit (15, 18) kurz mitgeteilt habe, steht in engster Beziehung zu dem Verhältnis der Kerngröße der beiderlei Larven eine Proportion der Kernzahl und also auch der Zellenzahl. Schon ein flüchtiger Blick auf Figg. 1b und 2b lehrt, daß die großkernige amphikaryotische Larve auf gleichem Bereich erheblich weniger Kerne besitzt als die kleinkernige hemikaryotische. Zahlenmäßig habe ich darüber Folgendes festgestellt. Auf den Zeichnungen der Figg. 1b und 2b wurden die Ektodermkerne der indifferenten Körperwand (also mit Ausschluß der Wimperschnurkerne) gezählt, was für die a m phikaryotische Larve 167, für die hemikaryotische 317 ergab.

Für eine Zählung der Wimperschnurkerne sind die beiden, in ziemlich kleinem Maßstab ausgeführten Zeichnungen nicht genau genug. Es liegen nämlich, besonders in der kleinkernigen Larve, die Kerne durchgehends in mehreren Schichten; nur die höchsten und sich nicht deckenden sind in den Figuren wiedergegeben. Zum Zweck der Zählung wurde von jeder Larve mit stärkerer Vergrößerung die Hälfte des analen Wimperschnurbereichs von der Medianebene bis zur Umbiegung in die Seitenregion mit Ausschluß der Randpartie, wo sich die Kerne zu decken beginnen, genau gezeichnet. Es ergab

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die amphikaryotische Larve 86 Kerne die hemikaryotische Sonach besäße die aus dem kernhaltigen Fragment stammende Larve etwas über halb so viele Kerne als die aus dem kernlosen. Natürlich sind diese Zählungen nur annähernd genau, und es ist sehr wohl möglich, daß bei Zählung sämtlicher Kerne der beiden Larven das Ergebnis ein etwas anderes wäre. Aber daß das Verhältnis ungefähr das von 1: 2 ist, ist sicher.

Die übrigen Larven der beiden Kategorien stimmen mit den beschriebenen überein. Sämtliche amphikaryotische Plutei des Versuches weisen in Größe und Dichtigkeit der Kerne die Verhältnisse der Fig. 1b auf. Die 6 hemikaryotischen Plutei, die der Versuch außer dem beschriebenen noch ergeben hatte, zeigten sich kleinkernig und entsprechend vielzellig. Leider gingen sie, ehe ich sie genauer untersuchen konnte, durch eine Ungeschicklichkeit verloren, so daß ich speziellere Angaben über sie nicht machen kann.

Versuch vom 25. März 1902.

Nur 11

Aus fragmentierten Eiern von Echinus microtuberculatus wurden 24 kernlose Stücke isoliert und dann befruchtet. davon zeigten typische Zweiteilung und wurden weitergezüchtet. Das Ergebnis dieser Zucht war sehr ungünstig; es entwickelte sich nur eine einzige normale Gastrula, die, da sie über dieses Stadium nicht hinauszugehen schien, am 27. März getötet wurde.

Von den isolierten kernhaltigen Fragmenten wurden 15 typisch zweigeteilte weitergezüchtet. Zwei davon, welche sich in sehr kleinen Schälchen befanden, wurden während der Gastrulation krank und deshalb aufgegeben. Die übrigen 13 entwickelten sich zum größeren Teil gut; am 27. März wurden gleichzeitig mit der hemikaryotischen Gastrula 2 möglichst ähnliche amphikaryotische konserviert. Die übrigen 11 hatten am 28. März 7 normal gebildete Plutei ergeben, die nun abgetötet wurden.

Gleichzeitig mit diesen wurden die aus dem allgemeinen Schüttelmaterial entstandenen Larven getötet und die Zwerglarven herausgesucht. Endlich wurden zur gleichen Zeit Plutei einer normalen Kontrollzucht von den gleichen Eltern konserviert.

Der Versuch ergab also nur ein einziges isoliert gezüchtetes arrhenokaryotisches Objekt vom Stadium der fertigen Gastrula, zu diesem zwei ungefähr entsprechende, isoliert gezüchtete Vergleichsobjekte aus kernhaltigen Fragmenten. Figg. 3 und 4 zeigen eine Anzahl Ektodermkerne der beiden amphikaryotischen Larven, Fig. 5 eine entsprechende Region der hemikaryotischen. Sowohl das Verhältnis in der Größe, wie in der Dichtigkeit der Kerne ist genau das gleiche wie im vorigen Versuch.

Des weiteren wurden die 7 Plutei, die aus den kernhaltigen Fragmenten hervorgegangen waren, auf ihre Kernverhältnisse untersucht. Sie zeigen ganz übereinstimmend die Kerngröße und ungefähr die Dichtigkeit des Pluteus der Fig. 1. Desgleichen stimmen 50 beliebig ausgewählte und dann auf Größe und Zahl der Kerne untersuchte Plutei der normalen Kontrollzucht vollkommen miteinander überein. Aber, was nun noch speziell hervorzuheben ist, die Kerngröße aller dieser sicher amphikaryotischen Larven von sehr verschiedener Größe und im Stadium zwischen weit vorgeschrittenen Gastrulae und wohlausgeprägten Plutei sich bewegend, ist wesentlich die gleiche und schwankt innerhalb von Grenzen, welche gegenüber dem Gegensatz,

in dem alle diese Objekte zu der hemikaryotischen Gastrula (Fig. 5) stehen, verschwinden.

Mit dieser Gleichartigkeit kontrastiert in der zu erwartenden Weise das Ergebnis der Prüfung der aus dem Schüttelmaterialin Massenkultur entstandenen Zwerglarven. Es ist klar, daß darunter sowohl amphikaryotische wie hemikaryotische Objekte sein müssen, und demgemäß finden sich hier Zwergplutei von zwei aufs klarste unterschiedenen Kerntypen. Die einen weisen die Kerngröße der Normallarven und der isoliert gezüchteten amphikaryotischen Zwergplutei auf, die anderen verhalten sich in Größe und Zahl der Kerne zu ihnen wie der hemikaryotische Pluteus der Fig. 2 zu dem amphikaryotischen der Fig. 1. Nur ist es in der Massenkultur, wo die schädigende Wirkung des Isolierens wegfällt, leicht, von beiden Typen ältere Plutei mit wohlentwickelten Anal- und Oralarmen zu erzielen.

Mit unseren letzten Konstatierungen sind einige Fragen berührt, deren genauere Erörterung an dieser Stelle eingeschaltet sein mag. Sollen die Untersuchungsergebnisse streng beweisend sein, so ist die Voraussetzung zu machen, daß die normalen Larven eines Elternpaares hinsichtlich ihrer Kerngröße und relativen Kernzahl einen völlig gleichartigen Typus darstellen. Würden unter ihnen solche Verschiedenheiten vorkommen, wie zwischen Figg. 1b und 2b oder zwischen Figg. 4 und 5, so würde auch bei isolierter Züchtung unser Ergebnis nichts beweisen. Es ist daher notwendig, über diesen Punkt volle Sicherheit zu gewinnen.

Es ist soeben für den letztbesprochenen Versuch konstatiert worden, daß 50 beliebig ausgewählte Plutei der normalen Kontrollzucht hinsichtlich der Größe und Dichtigkeit der Kerne sich vollkommen gleichartig beschaffen zeigten, und es ist nun noch hinzuzufügen, daß Abweichungen überhaupt nicht zur Beobachtung kamen.

Diese durchgängige Uebereinstimmung zwischen den normalen Larven einer Zucht habe ich auch bei anderen Proben gefunden. Ich habe außerdem einen meiner Schüler, Herrn Dr. H. SCHMIDT, veranlaßt, an einer von mir in Neapel konservierten Serie von Echinus microtuberculatus, die in Etappen von 20 Minuten die Stadien von der zehnstündigen Blastula bis zum Pluteus umfaßt, eine Vergleichung der Kerngröße vorzunehmen. Die Arbeit des Herrn SCHMIDT ist inzwischen erschienen (42). Es ist demselben. kein einziges normal gebildetes Exemplar vorgekommen, welches

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